长片段融合PCR在构建烟曲霉rho1基因回补株中的应用

中国真菌学杂志　 2013, Vol. 8 　Issue (3): 129-133.

论著下一篇

长片段融合PCR在构建烟曲霉rho1基因回补株中的应用

韩改革^1,2, 贾晓东², 韩雪琳², 赵帅², 韩黎²

1. 中南大学基础医学院, 长沙 410000;
2. 中国人民解放军疾病预防控制所, 北京 100071

收稿日期:2013-05-06 出版日期:2013-06-28 发布日期:2013-06-28
通讯作者: 韩黎,E-mail:hanlicdc@163.com E-mail:hanlicdc@163.com
作者简介:韩改革,男 (汉族),硕士研究生在读.E-mail:haiwangxiao@126.com
基金资助:
国家自然科学基金(81101229)

The application of long-fragment fusion PCR in the construction of rho1-compelement strain of Aspergillus fumigatus

HAN Gai-ge^1,2, JIA Xiao-dong², HAN Xue-lin², ZHAO shuai², HAN li²

1. School of Basic Medical Sciences, Central South University, Changsha 410000, China;
2. Institute for Disease Control & Prevention of People's Liberation Army, Beijing 100071, China

Received:2013-05-06 Online:2013-06-28 Published:2013-06-28

摘要/Abstract

摘要： 目的融合PCR是一种常用的构建重组片段或重组质粒的手段,但长片段融合PCR的难度较大。文中将探讨长片段融合PCR过程中引物设计及扩增条件对产物的影响。方法以构建烟曲霉 rho1基因回补株为例,采用融合PCR的方法扩增重组片段 (长达6.5 kb),在引物设计时引入不同大小的同源区,并设置不同的扩增体系。结果当设计引物的同源区为35 bp,选用具有高扩增效率、高保真性的DNA聚合酶,以及各片段在融合PCR反应体系中的浓度为15 ng/μL时,实现了长达6.5 kb的片段扩增并完成了烟曲霉rho1回补株的构建。结论在合适的PCR引物设计、片段浓度配比及聚合酶条件下,长片段融合PCR在丝状真菌的基因敲除及回补株的构建中是一种非常有效的工具。

关键词: 融合PCR, 烟曲霉, rho1, 基因回补

Abstract: Objective To evaluate the effect of primer design and the amplification condition on long-fragment fusion PCR.Methods With the example of 6.5 kb-long fragment amplification by fusion-PCR during construction of rho 1 gene complement in Aspergillus fumigatus, primer design with diverse homologous regions and different condition for amplification were evaluated.Results The 6.5 kb-long fragment was successfully amplified by fusion-PCR under following conditions: the primers with homologous region of 35 bp; DNA polymerase with high amplification efficiency and high fidelity; the concentration of template fragments higher than 15 ng/μL in whole reaction system.Conclusion With the appropriate primer, DNA polymerase and concentration of templates, the fusion PCR for the long-fragment might be a highly-efficient tool in gene-manufacturing of filamentous fungi.

Key words: fusion PCR, Aspergillus fumigatus, rho1, gene complement

中图分类号:

R379.6

韩改革, 贾晓东, 韩雪琳, 赵帅, 韩黎. 长片段融合PCR在构建烟曲霉rho1基因回补株中的应用[J]. 中国真菌学杂志, 2013, 8(3): 129-133.

HAN Gai-ge, JIA Xiao-dong, HAN Xue-lin, ZHAO shuai, HAN li. The application of long-fragment fusion PCR in the construction of rho1-compelement strain of Aspergillus fumigatus[J]. Chinese Journal of Mycology, 2013, 8(3): 129-133.

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长片段融合PCR在构建烟曲霉rho1基因回补株中的应用

The application of long-fragment fusion PCR in the construction of rho1-compelement strain of Aspergillus fumigatus

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